肌本来の強さを引き出す皮膚研究｜生命科学に関する技術｜基盤研究｜研究開発

1.研究背景

皮膚（肌）は、身体全体を覆う最大の臓器であり、外界からの刺激や異物の侵入を防いだり、体内の水分が失われるのを防ぐなど、重要な役割（バリア機能）を果たしています。このバリア機能の低下は、乾燥肌などの肌トラブルにつながることが知られています。
生活者調査によれば、年齢とともに乾燥などの肌悩みを感じるようになった40歳前後の女性の約9割が、スキンケアをしても乾いてしまうと回答しています^※1。乾燥肌に対して肌の表面にうるおいを与えるケアだけではなく、肌本来の強さを引き出すことで肌悩みにアプローチする技術開発を進めています。

1 スキンケアに対する意識調査（2022年11月、当社調べ、35～49歳女性、n=2283）

2.皮膚の第2のバリア機能を担うタイトジャンクション

皮膚は､「表皮」、「真皮」、「皮下組織」から成り、さらに表皮は「角質層」、「顆粒層」、「有棘層」、「基底層」で構成されています（図1a）。皮膚の最外層に位置する角質層では、外部刺激である紫外線や乾燥などから身体を守る、第1のバリア機能を担っています。一方、角質層よりも内側にある顆粒層では､「タイトジャンクション（TJ)」と呼ばれる細胞同士を繋ぐ密着結合が第2のバリア機能を担い、体内の水分保持に関わっています（図1b）^※2。

2 日本美容皮膚科学会監修『あたらしい美容皮膚科学』（南山堂, 2022）

タイトジャンクション（TJ）は、細胞同士の接着に関わる複数のTJ構成タンパク質（TJ因子）で形成されています。TJ因子は、細胞内で産生された後、細胞膜上へと移行します。そして、隣接するTJ因子どうしが結合する（図2）ことで細胞間を接着し、細胞間の物質通過を抑制するバリアとして機能しています（図1b）^※3,4,5。つまり、第2のバリア機能においては、細胞膜上に存在するTJ因子が重要な働きを担っていると考えられます。
そこで私たちは、細胞膜上のTJ因子増加に寄与する成分を探索しました。

3 久保亮治: 皮膚タイトジャンクションバリア構造の詳細な理解, 日本皮膚科学会雑誌, 2014, 124巻, 3号
4 French, A. D. et al.: PKC and PKA phosphorylation affect the subcellular localization of claudin-1 in melanoma cells. Int. J. Med. Sci, 6, 93-101, 2009.
5 Kobayashi, M. et al.: Weak ultraviolet B enhances the mislocalization of Claudin-1 mediated by nitric oxide and peroxynitrite production in human keratinocyte-derived HaCaT cells. Int. J. Mol. Sci, 2020.

3.研究内容：TJ因子増加に寄与する成分の特定

細胞膜上のTJ因子増加に寄与する成分の特定は、独自に構築した“生細胞免疫染色法”を用いました｡これは、細胞の接着特性を活用し、細胞膜上のTJ因子を特異的に蛍光標識する抗体を採用することで、簡便かつ精度高く、細胞膜上のTJ因子を選択的に染色する方法です。
TJ因子増加の既知成分（Ca²⁺)及び各候補成分を表皮角化細胞に添加し、生細胞免疫染色法によりTJ因子を染色した結果、ヘパリン類似物質とピリドキシン類縁体では、コントロール群と比較して有意に蛍光強度が増加しました（図3a）。また、画像評価では、細胞膜の形に添った緑色の線（図3b）が確認されました。これらのことから、2成分が細胞膜上のTJ因子を増加させることが示されました。

次に、各成分がTJ因子を増加させるメカニズムを明らかにするため、ウエスタンブロット法を用いて、細胞全体のTJ因子発現量と細胞膜上のTJ因子発現比率を評価しました。
まず、“細胞全体のTJ因子の発現量”について評価しました。その結果、ヘパリン類似物質を添加した場合、TJ因子の発現量が有意に増加しました。また、ピリドキシン類縁体はCa²⁺と同程度の発現量に達することが確認されました（図4）。
続いて、“細胞全体のTJ因子発現量”に対する“細胞膜上のTJ因子発現量”の割合を算出し、コントロールの比率を1とした際の細胞膜上のTJ因子発現比率を評価しました。その結果、ピリドキシン類縁体を添加した場合、細胞膜上のTJ因子の割合が有意に増加することを確認しました（図5)。これらの結果から、ピリドキシン類縁体は、特にTJ因子を細胞膜上へ移行する働きが高いことが推測されました。